ncRNAによる転写後制御について

2017年9月18日 2017年10月16日

管理人

2006年にRNAiの発見によって、クレイグ・メローとスタンフォード大学教授のアンドリューファイアーは、ノーベル医学生理学賞を受賞した。RNAi (RNA interference：RNA干渉) は、(外来性の)二本鎖RNAの一方と完全に相補的な塩基配列を持つmRNAが分解される現象であり、これまでのRNAの役割に対する認識を一変させた。natureのサイトにRNAiに関する動画がありましたので紹介から。

参考URL：http://www.nature.com/nrg/multimedia/rnai/animation/index.html

siRNAについて

【穴埋め問題１】

　RNAにはmRNA、tRNA、rRNAのようにセントラルドグマを担う３種類の存在が知られている。これらのRNAの他に転写後制御に関わる重要なRNAが存在している。1990年にジョーゲンセンとモルらによりペチュニアに対する色素合成酵素遺伝子の過剰導入実験によって、ペチュニアの色素発現が抑制されるという結果が得られた。この現象は転写後（　１　）と呼ばれ、後にRNAiの機構解明への手掛かりとなった。1998年に（　２　）と（　３　）は、（　４　）を用いた実験により、RNAが遺伝子の発現制御を担っていることを発見し、2006年にノーベル医学生理学賞を受賞した。この実験では筋線維タンパクをコードするunc-22のエクソンに対応するセンスRNA、アンチセンスRNA、２本鎖RNA(センスとアンチセンスによる)をセンチュウの体内へ注入する実験により、注入された個体がtwicherの表現型を示し、そして上記の２本鎖RNAの注入個体と野生型の交雑により得られた個体にも同様の表現型が得られた。このことから、注入した２本鎖RNAがRNA輸送膜タンパクによって２本鎖RNAがセンチュウの体内全域に拡散し、更には生殖細胞にまで拡散されることで次世代に継承され、次世代においてもunc-22の発現が阻害され、上記のような表現型が得られたと考えられた。ここでの注入された２本鎖RNAの増幅には（　５　）が関わっていると考えられる。
ペチュニアにおいて上記の機構を見てゆく。もし仮に、細胞内において一本鎖RNAが過剰に存在していた場合、上記のRNA依存性RNAポリメラーゼによって、2本鎖RNAが合成される。そして（　6　）によって小さなRNA断片に切断されsiRNA (small interfering RNA)が生じる(注1)。そして（　７　）タンパクに取り込まれ、RISC (RNA-induced silencing complex)と呼ばれる複合体を形成する。そして、この複合体にはRNAse活性があるため、取り込まれた２本鎖RNAの一方は分解され、RISC内に残された１本鎖RNAと部分的に完全に相補的なRNAが細胞内にまだ過剰に存在している場合、それらと結合することでその標的RNAを分解することになる。この２本鎖RNAの一方と完全に相補的な塩基配列をもつmRNAが分解される機構をRNAi(RNA interference)と呼ぶ。(翻訳阻害ではなく、完全に相補的かつ分解であることに注意！)

このsiRNAによるRNAi機構は、センチュウにおいても見られ(注2)、単細胞の菌類、また植物においても見られる。この機構はRNAウイルスに対する生体防御機構としての働いていると考えられ、脊椎動物の獲得免疫応答と似た側面があると言える。侵入してきた外来性のRNAゲノムを撃退するためにRNAiを用いていると考えられる。その後、2001年にトーマストゥスキルらの実験によって、２本鎖RNAが細胞内に導入されると高等哺乳類でもRNAiが引き起こされることが判明した。これ以降、ある遺伝子に対してその遺伝のmRNAに相同な２本鎖RNAを細胞内へ導入することにより、遺伝子の発現を制御する手法である（　８　）が用いられることとなった。

さて、高等動物ではRNA依存性RNAポリメラーゼは存在しておらず、RNAiのような機構はヒトでは存在しないのか？という疑問が残る。高等哺乳類においては、siRNAの加工に関わる因子がmiRNAの加工に関わっていることがわかっている。(続きは穴埋め問題２へ)

(参考:1990年ジョーゲンセンのペチュニアの実験　http://www.plantcell.org/content/2/4/279)

(参考:1990年モルのペチュニアの実験　http://www.plantcell.org/content/2/4/291)

(参考:1998年クレイグメローとアンドリューファイアーのセンチュウ実験　https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9486653)

(参考:2001年トーマストゥスキルのsiRNAがヒト細胞においてRNAiを引き起こした実験　https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11373684?dopt=Abstract)

【答え】

1.遺伝子サイレンシング、2.3.クレイグメロー、アンドリューファイアー、4センチュウ、5.RNA依存性RNAポリメラーゼ、6.ダイサー(Dicer)、7.アーゴノート(Argonautes)、8.ノックダウン

注1 ：siRNAの定義は確立されていない。細胞外から導入されたRNA由来のもののみをsiRNAと呼ぶこともあるようだが、細胞自身のncRNA由来のsiRNAも存在する。また、それ以外にダイサーによって切断された２本鎖RNAがAGOに取り込まれて、１本鎖になったものをsiRNAと呼ぶこともあるようだ。このサイトでは、naturaの動画でも言われているように、細胞自身か細胞外から導入された２本鎖RNAがダイサーによって切断されて生じた低分子２本鎖RNAをsiRNAと呼ぶことにする。しかし、後述するが、miRNAはダイサーで切断された２本鎖RNAはmiRNA/miRNA✳︎と各々呼ばれているため、ダイサーで切断され、AGOに取り込まれて１本鎖RNAになったものをsiRNAと呼ぶ方がいいのではないかと管理人は考えるのだが、natureの動画はかのメローが監修しているようなのでそれに従うことにします。。。

注2：ペチュニアにおいては、RNA依存性RNAポリメラーゼによって、1本鎖RNAが過剰になると、1本鎖RNAから2本鎖RNAを合成し、Dicerで切断してAGOに取り込まれ１本鎖のsiRNAが生成したが、センチュウに関しては、1本鎖RNAから2本鎖RNAは合成されない。しかし、2本鎖RNAから2本鎖RNAを合成するRNA依存性RNAポリメラーゼが存在している。そして、2本鎖RNAが過剰になるとRNAiが発動する。ちなみにRNA依存性RNAポリメラーゼは高等動物には存在しない。

miRNAについて

【穴埋め問題２】

　時を同じくして、1993年にヴィクターアンブロスらはセンチュウ用いた実験により、後胚発生に必要な遺伝子lin-4には、lin-4に対するアンチセンス鎖をもつ小さいRNAがコードされている、ということを見出した。これは世界初の（　１　）の発見であった。これは、２本鎖RNAから作られるsiRNAとは異なり、ゲノムにコードされているncRNAが遺伝子制御を行なっているというものであった。

このncRNAの生成について見てゆく。まず、ゲノムに存在するncRNA遺伝子が主にRNAポリメラーゼ（　２　）によって転写される。この転写産物である１本鎖RNAは核内でプロセシングを受けるため、5'キャップと３’ポリA鎖を有する。また自身で（　３　）構造を形成し（　４　）miRNAとなる。

核内では次に、酵素である（　５　）によって切断された後、（　６　）miRNAになる。そして、キャリアタンパクである（　７　）によって核外へ輸送される。

(以下siRNAと共通)

細胞質ではsiRNAの切断でもお馴染みの（　８　）によってさらに細かく切断され、約２０程度の２本鎖の（　９　）miRNA(miRNA/miRNA✳︎とも呼ぶ)となる。そしてこの２本鎖RNAが（　１０　）タンパクに取り込まれ、RNAse活性により2本鎖の一方であるmiRNA✳︎が追い出されて分解される。こうして残った、miRNAを含む複合体を（　１１　）と呼ぶ。このmiRNAには5'側に7塩基程の（　１２　）配列が存在し、標的mRNAの（　１３　）領域(3'UTRと呼ぶ)に結合する。この配列は完全に相補的でなくても機能するため、１本のmiRNAは多様なmRNAを標的としていると考えられる。

siRNAとmiRNA以外のncRNAとしては長鎖ncRNAの存在が知られている。ヒトでは約８０００種類以上存在すると考えられているが、まだ多くは解明されていない。しかし、長鎖ncRNA領域の一例としては、X染色体の不活性化に関わるタンパクXistをコードするXistが知られている。発生の初期において、雌の各々の細胞核ではX染色体の一方から転写産物Xistが作られる。転写されたX染色体は高度に（　14　）化され不活性化される。

(参考:1993年 ヴィクターアンブロスらのセンチュウにおけるlin-4の発見　https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8252621)→世界初のmiRNAの発見

(参考:2010年 miRNAの総説 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3048316/#R1 )

【答え】

1.miRNA、2.Ⅱ、3.ヘアピンループ(構造)、4primary (pri-)、5.ドローシャ、6.precursor (pre-)、7.Exportin５、8.ダイサー、9.mature(成熟)、10.アーゴノート(タンパク)、11.RISC(RNA-induced silencing complex)、12.seed(配列)、13.３'非翻訳領域(３'-untransrated region)、14.ヘテロクロマチン(化)

【ncRNA　記述対策】

【問題1】

siRNAとは何か説明し、その意義についても述べよ。

【答え】

主に外来性の長い２本鎖RNAから生成する、約20塩基程の低分子２本鎖RNAである。アーゴノート(以下AGO)に取り込まれてRISCを形成した後、１本鎖RNAとなる。そしてこれに相補的な標的mRNAに結合する。AGOはスライサー活性を有しており、相補性が高い場合は標的mRNAは分解されるRNAiが生じる。相補性が高くない場合は、AGOが誘導するサイレンシング因子によってmRNAの翻訳阻害が起こり、遺伝子発現を制御している。RNAiの機構を用いて、標的mRNAを実験的に抑制するノックダウンとしても用いられる。

【ポイント】

siRNAは、主にウイルスなど外来性の長い２本鎖RNAから生成する、２０塩基程の２本鎖RNAのこと。(ココがmiRNAと異なる！)

　　注：自身の細胞由来のRNAから生じるsiRNAも存在するので、冒頭に"主に"と書いた。

ダイサーで切断されて２０塩基程になり、AGOに取り込まれ１本鎖になる。

　　注：定義が統一されていないので、このAGOに取り込まれた後、１本鎖になったRNAをsiRNAと呼ぶこともある。

AGOスライサー活性の強い場合→標的mRNAは分解(RNAi)
AGOスライサー活性の弱い場合→標的mRNAは翻訳阻害(アーゴノートが呼び寄せるサイレンシング因子による)
外来性のウイルス等RNAゲノム排除のための生体防御機構としての存在している。(ココがmiRNAと異なる！)
標的mRNAを分解するRNAiの機構はノックダウンにも用いられる。(ココがmiRNAと異なる！)

【問題2】

miRNAについて説明しろ。

【答え】

miRNAは内因性のゲノムにコードされているncRNAであり、１本鎖RNAから生成する約20塩基程の１本鎖RNAであり、遺伝子発現制御を行う。がん細胞と正常細胞におけるmiRNAのプロファイルに違いがあることがわかってきており、バイオマーカーとしての利用が期待されている。

【ポイント】

miRNAはゲノム上にコードされていて、１本鎖RNAから生じる１本鎖RNAである事に注意。(siRNAとココが異なる！)

　　　ダイサーで切断された後はmiRNAとmiRNA✳︎のと呼ばれる２本鎖になるので、miRNAは１本鎖である。

核内：プロセシング → pri-miRNA → ドローシャに切断 → pre-miRNA (Expotin５で核外へ)　(siRNAとココが異なる！)
核外：ダイサーに切断されてmature miRNA(miRNA/miRNA✳︎) ２０塩基程になり、AGOに取り込まれる。
AGOスライサー活性の強い場合→標的mRNAは分解(RNAi)
AGOスライサー活性の弱い場合→標的mRNAは翻訳阻害(アーゴノートが呼び寄せるサイレンシング因子による)
がん細胞などでは、miRNAのプロファイルが通常と異なっており、診断や治療におけるバイオマーカーとしての利用が期待されている。(siRNAとココが異なる！)

【問題3】

siRNAとmiRNAの違いについて説明しろ。

【答え】

siRNAは主に外来性の長い２本鎖RNAから生成する、約20塩基程の２本鎖RNAであり、外来性のRNAゲノム排除のための生体防御機構としての働きが主体である。他方、miRNAは内因性のゲノムにコードされているncRNAであり、１本鎖RNAから生成する約20塩基程の１本鎖RNAであり、遺伝子発現制御としての働きが主体である。

【ポイント】

siRNAはウイルスのRNAゲノム等、外因性の長い２本鎖RNAからダイサーによって短く切られて生成する２本鎖RNAであるのに対し、miRNAは内因性のゲノムにコードされてるもので、１本鎖RNAがヘアピンループを形成して核内でドローシャに切られ、核外でダイサーに短く切られて生成する１本鎖RNAのこと。

共通するのは、

短く切られて生成したsiRNAとmiRNAは共に、AGOに取り込まれRISCを形成する。
AGOスライサー活性の強い場合→標的mRNAを分解
AGOスライサー活性の弱い場合→標的mRNAの翻訳阻害

注意：siRNAに関して、外来性のウイルスRNAゲノムが発端となる場合、生成するsiRNAはその外来性のRNAゲノムである。その為、形成されるRISC内に存在するRNAが結合する標的mRNAは完全に相補的となり、分解される。(RNAi)

【問題4】

ncRNAとは何か、またその機能は何か述べよ。

【解答例】

タンパク質をコードしないRNAである。mRNA、tRNA、rRNA以外にも、遺伝子発現制御に関わるsiRNAやmiRNAといった低分子ncRNA、そして作用機序の不明な点の多い長鎖ncRNAも存在している。

【ポイント】

ncRNAにはm、t、rRNA以外にsiRNAとmiRNA(他にもpiRNA)、そして長鎖ncRNA(例は後述するXist) があることを覚えておく。

【問題5】

siRNAは様々な遺伝子発現制御実験において用いられるが、その遺伝子発現抑制機構について述べよ。(類題：ノックダウンについて述べよ)

【答え】

細胞内に導入された２本鎖RNAはダイサーによって切断されsiRNAが生じる。siRNAはアーゴノートとRISCを形成後、１本鎖RNAとなる。これに完全に相補的なmRNAはスライサー活性によって切断され遺伝子発現が抑制される。

【ポイント】

RNAiについて書く。AGOのスライサー活性で標的mRNAに完全相補的に、かつ分解する。

【問題6】

植物やセンチュウにおいてはRNA依存性RNAポリメラーゼが存在し、過剰な一本鎖RNAに対してRNAiが作動する。この発動の流れを以下の用語を用いて説明し、機構の意義についても述べよ。(一本鎖RNA、RNA依存性RNAポリメラーゼ、ダイサー、siRNA、アーゴノート、RISC、RNAse、mRNA、スライサー活性)

【答え】

この機構の意義は外来性のRNAウイルスゲノムを撃退する生体防御機構としての働きがある。細胞内に存在する過剰な１本鎖RNAは、RNA依存性ポリメラーゼによって２本鎖RNAに変換された後、ダイサーによって切断され２０塩基程の低分子２本鎖RNAであるsiRNAが生じる。siRNAはアーゴノートに取り込まれRISCを形成後にRNAse活性により１本鎖RNAとなる。存在するmRNAと相補性が高い場合は、アーゴノートのスライサー活性によってmRNAは切断される。相補性が低い場合は、アーゴノートに誘導されるサイレンシング因子により翻訳が阻害される。

【問題7】

RISCとは何か、説明せよ。

【答え】

RNA-induced silencing complexの略であり、20塩基程の低分子RNAがアーゴノートに取り込まれて形成される複合体のこと。内部のRNAと相補性を持つmRNAと結合することにより当該遺伝子の発現を抑制する。

【問題8】

seed配列とは何か、説明せよ。

【答え】

miRNAの５'末端側の７塩基をseed配列と呼び、この配列と相補的な配列をもつmRNAはmature-miRNAの標的として認識されて、mRNAの３-UTR'に結合する。

【ポイント】

３'-UTRとは３'末端側非翻訳領域のこと。UnTranslated Regionの略。mRNAのコドンより更に３'末端側に存在する領域であって、miRNAはmRNAの３'末端側非翻訳領域に結合する。

【問題9】

長鎖非翻訳RNAの一例を挙げて、その役割について説明せよ。

【答え】

X染色体に存在するXistがその一例である。転写されたXistはスプライシングを受けた後、翻訳はされずに転写された側のX染色体を高度にヘテロクロマチン化させ不活性化する。

【ポイント】

長鎖ncRNAの例といったらXist！これをすぐに思い出せるようにする。これはLyon現象に関係している。

【問題10】

RNAサイレンシングとは何か説明せよ。

【答え】

RNAサイレンシングとは，20塩基程の低分子RNAを介し，それと相補的な配列領域をもつ遺伝子の発現が抑制される現象である．主に外因性のウイルスゲノム由来の二本鎖RNAから生じるsiRNAが生体防御システムとしてはたらくRNAi経路、そして内因性のncRNA領域から生じるmiRNAが遺伝子発現制御を行うmiRNA経路の2つがある。いずれの経路においても低分子RNAがアーゴノートに取り込まれてRISCを形成後，相補的な配列をもつmRNAの発現を抑制する。

【ポイント】

要は、siRNAとmiRNAのことについて書けば良い。
低分子RNAが遺伝子制御を行う→主に生体防御のためのsiRNAと、遺伝子発現制御のmiRNAが存在する。
どちらの経路も低分子RNAがAGOに取り込まれてRISC形成後、１本鎖になって相補的なmRNAを分解、または翻訳阻害する。

【問題11】

miRNAの生成は、核内において自身のゲノムにおけるncRNAの転写産物が、自身で部分的にとはいえ、塩基の相補性によってヘアピンループを形成することにより生じる。しかし、それには部分的にとはいえ、ある程度の長さで相補性が確保されている必要がある。なぜその部分的、ある程度の長さで塩基の相補性が確保されている考えられるか述べよ。(創作問題)

【答え】

miRNAはncRNA領域からの転写産物である。ncRNA領域はレトロトランスポゾンによって生じた繰り返し配列が存在しており、部分的かつある程度の長さで相補性が確保されていると考えられる。

【ポイント】

レトロトランスポゾンは逆転写酵素によって、自身のゲノムをコピーアンドぺーストで増やしてゆくことが可能である。

レトロトランスポゾンに関してはこちら→コチラ

【問題12】

miRNAの５'側に存在する７塩基程のseed配列はある程度の相補性でも機能する。この意義について述べよ。

【答え】

一つのmiRNAで、多くのmRNAを標的にすることが可能となる。

【問題13】

piRNAついて述べよ。

【答え】

Piwiタンパクと結合して作用する非コードRNAのこと。piRNA複合体は、生殖細胞におけるレトロトランスポゾンの発現制御に関わっている。

【ポイント】

piRNAとは、Piwi-interacting RNAの略である。

Piwiタンパクと結合して作用するncRNAを指す。Piwiタンパクはアーゴノートのサブファミリーである。
piRNA複合体は、生殖細胞におけるレトロトランスポゾンの発現制御に関わっている。

(参考:http://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(07)00322-X)

【問題14】

近年、miRNAはバイオマーカーとしての役割が期待されている。非常に不安定とされているRNAがなぜ血液、尿、唾液等からな採取できるのか答えよ。

【答え】

全身の細胞は、miRNAをエキソソームによって細胞外に輸送しており、エキソソーム内では比較的安定して存在しているから。

【ポイント】

miRNAはエキソソームに包まれて細胞外輸送されていて、比較的安定している為、血液や尿をサンプルとして採取可能であり、バイオマーカーとして利用できる。また、がん細胞では正常細胞と比べてmiRNAのプロファイルが変化しており、がんの診断、治療に応用できる可能性が考えられている。　(参考文献:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16461460)

【問題15】

ncRNAをコードする領域における塩基配列の突然変異は、発がんに関係している。例を挙げて説明せよ。

【答え】

ncRNAのコード領域における塩基配列の突然変異によって、通常は作用しないはずの、あるがん抑制遺伝子の遺伝子発現を変異miRNAが阻害してしまう可能性がある。また、がん原遺伝子の翻訳を抑制するncRNAのコード領域の突然変異によって、変異miRNAが、がん原遺伝子のmRNAを阻害できなくなる可能性があるから。

【ポイント】